Establecer un laboratorio que funcione bien para el cultivo de células madre pluripotentes inducidas (hPSCs, por sus siglas en inglés) proporciona la base para una cultivo y experimentación exitosos.
En este artículo describiremos las consideraciones principales para establecer un laboratorio exitoso de grado de investigación de las PSC, mientras que el cultivo de hPSCs se lleva a cabo en un laboratorio que no es muy diferente de uno utilizado para cultivar otros tipos de células humanas, debido al estatus especial de estas células, hay un mayor grado de supervisión, revisión, y presentación de informes.
Hemos encontrado que una cantidad casi igual de tiempo y esfuerzo se requiere para establecer los protocolos iniciales y buscar la aprobación para el cultivo y la obtención de líneas celulares humanas pluripotentes que se necesitan para diseñar y equipar el laboratorio.
Diseño de laboratorios de investigación de células madre
Ya sea la adaptación de un laboratorio existente o el diseño de uno nuevo en el recinto, los problemas básicos son los mismos, hay que considerar el equipo, el número de personas y el tipo de actividades a realizar para lograr el mejor diseño (dentro de las restricciones presupuestarias).
El uso de sistemas prefabricados para laboratorios, permite ampliar el mismo según sea necesario añadiendo más módulos de cultivo de tejidos y personal para administrar la carga de trabajo.
Las consideraciones clave para establecer un laboratorio
- Definir el alcance del trabajo que incluye el número y el tipo de líneas celulares a cultivar
- Determinar el número de personas que trabajarán en este y sus tareas específicas
Se debe considerar, por ejemplo, cómo se mantendrán y caracterizarán las líneas, si se cultiva más de una línea de PSC simultáneamente, ¿qué medidas de seguridad se aplicarán para prevenir la contaminación cruzada? ¿cómo se introducirán nuevas líneas en el laboratorio? ¿hay un área en la que poner en cuarentena estas nuevas líneas? deben realizarse adaptaciones para la recepción de los materiales entrantes, su prueba y almacenamiento, así como la eliminación adecuada de los desechos.
Cultivar las células madre es muy parecido a cultivar otros tipos de células, con algunas técnicas especiales adicionales.
Específicamente, el laboratorio de investigación de PSC, como mínimo, requiere espacio y equipo para: cultivo de tejidos, microscopía, bioquímica estándar y biología molecular.
Sin más, abarcaremos estos importantes puntos:
Equipo
A continuación enumeraremos el equipo mínimo requerido para el cultivo básico y la caracterización de hPSCs, un programa dado quizá requiera un equipo de cultivo especializado, por ejemplo, incubadoras que permitan el cultivo en baja tensión de oxígeno, o equipo de caracterización y análisis.
Los elementos necesarios para establecer un laboratorio de cultivo hPSC estándar son los siguientes (dependiendo del área).
Laboratorio de cultivo de tejidos
- Gabinete de bioseguridad de clase II
- Incubadora de dióxido de carbono
- Pipetas
- Frasco de vacío/dispositivo de aspiración
- Baño de agua (37 °C)
- Centrifugadora de baja velocidad (grado clínico, para células de hilatura)
Microscopía
- Microscopio de contraste de fase
- Microscopio de disección
Almacenamiento
- Gabinetes y estantes para el almacenamiento de suministros de cultivo de tejidos
- Refrigerador (4 °C)
- Congelador (-20 °C, sin descongelar)
- Congelador de baja temperatura (-70 a -85 °C)
- Congelador criogénico (almacenamiento por debajo de -140 °C, normalmente nitrógeno líquido)
Laboratorio de Biología Molecular/Laboratorio de Control de Calidad
- Reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés)
- Citómetro de flujo
- Microscopio de fluorescencia
- Microscopio confocal
Laboratorio de cuarentena
- Gabinete de bioseguridad de clase II
- Incubadora de dióxido de carbono
- Microscopio de contraste de fase
- Baño de agua (37 °C)
- Centrífuga de baja velocidad (grado clínico, para células giratorias)
- Pipetas
- Frasco de aspiración/vacío
- Fregadero
Equipos adicionales comunes en muchas instalaciones
- Microscopía
- Citometría de flujo
- Genómica
- Proteómica
- Producción de virus
- Vivarium
Métodos
Área de cultivo de tejidos
El cultivo de tejidos comprende un conjunto mínimo de equipo, denominado «módulo de cultivo de tejidos», se compone de un gabinete de bioseguridad, una incubadora de dióxido de carbono, un microscopio de contraste de fase y una centrífuga de baja velocidad, una fuente de vacío, un baño de agua, dos frascos de 2 litros, un controlador de pipeta, micropipetores y un armario o carrito al lado del BSC para facilitar el acceso a los suministros de cultivo de tejidos.
Si nos mantenemos en el concepto de sistemas prefabricados para laboratorios, es posible aumentar la producción al incrementar el número de módulos de cultivo de tejidos en el diseño de laboratorio.
En el laboratorio hPSC, esto usualmente requiere uno o dos técnicos, el acceso al almacenamiento criogénico, las centrifugadoras, los microscopios, los refrigeradores, y los congeladores es una necesidad para un laboratorio funcional del cultivo de células.
Sin embargo, éstos frecuentemente llegan a ser compartidos entre múltiples módulos o laboratorios dependiendo de los objetivos del programa de laboratorio general, si se instala un laboratorio de PSC contenido en uno ya existente de cultivo de células, se requerirá al menos un módulo de cultivo de tejidos, esto mejorará en gran medida la productividad y reducirá las posibilidades de contaminación cruzada.
Laboratorio de biología molecular y control de calidad
Este está compuesto por el equipo y los SOP requeridos para realizar una lista predeterminada de ensayos de caracterización que permita evaluar sistemáticamente la calidad de las células en cultivo.
Los cultivos se ponen a prueba para la expresión de marcadores específicos, estructura citogenética (cariotipo o SKY) y la capacidad de diferenciarse.
Recomendamos cubrir primero la primera sección de este artículo, de modo que tengas al final una idea más completa sobre el contenido a tratar.
Procederemos a explayar detenidamente los métodos a seguir para, a través de sistemas prefabricados para laboratorios, tener a nuestra disposición un medio de cultivo y experimentación de células madre
Diseño del laboratorio
Cuando se construye un nuevo espacio, el equipo de diseño generalmente incluye un arquitecto, un contratista, un constructor, un electricista, un mecánico, un fontanero y un director de laboratorio o gerente.
El equipo de diseño para la adaptación del espacio de laboratorio existente es generalmente más pequeño y menos formal, pero aun así está compuesto por un número de personas con habilidades especializadas, incluyendo el constructor, electricista, mecánico, fontanero y el director del laboratorio.
Dado que los costes de construcción de un espacio medio de laboratorio son 3-5 veces mayores que los de oficinas, el presupuesto es una consideración clave y debe establecerse como parte de la pre-planificación.
La naturaleza dinámica de la investigación biomédica y el costo de la construcción de los laboratorios han dado lugar al uso frecuente del diseño modular que permite la reconfiguración del laboratorio según sea necesario, manteniendo al mínimo los costos de construcción.
Consideraciones clave para la planificación y el diseño
- Presupuesto
- ¿Cuánto dinero gastar y cuánto tiempo?
- Retorno de la inversión (lo que se espera obtener a través de esta financiación)
- Espacio
- ¿De qué tipo? ¿es una nueva construcción, una extensión de un laboratorio existente o la total reconstrucción y rehabilitación de uno?
- ¿Cuánto espacio hay disponible?
- La construcción en fases, ¿cómo se relacionan entre sí las fases? ¿debe el plan incluir planos e ilustraciones para la eventual construcción de todo el espacio?
- Tipo y alcance del trabajo a realizar
- Nivel de bioseguridad del laboratorio
- Equipo principal
- Número de personas
- Principales áreas funcionales
- Laboratorio de cultivo de tejidos
- Laboratorio de cuarentena (opcional, pero deseado)
- Laboratorio de biología molecular y control de calidad
- Laboratorio de microscopía
- Personal
- ¿Cuánta gente se estima?
- ¿En qué área funcional funcionarán?
- ¿En cuántas oficinas?
- ¿Cuántos espacios de escritorio habrán, ya sean compartidos o dedicados?
- Sala de descanso
- Las habitaciones del congelador
- Cuántos y qué tipos de congeladores
- Generador de respaldo
- Sistema de alarmas
- Un cuarto congelador criogénico separado con acceso limitado
- Áreas de almacenamiento adyacentes al laboratorio
- Gabinetes
- Estantes con orillas de 1 pulgada para evitar que los objetos caigan
- Armarios
- Tecnología de la información
- Armario dedicado a esta área
Principales consideraciones sobre la construcción
A continuación describimos y enumeramos consideraciones de alto nivel que están ideadas para estimular el pensamiento por parte del director del laboratorio a medida que comienza a trabajar con su equipo de diseño o construcción para establecer un nuevo recinto para el cultivo de células madre pluripotentes inducidas.
- Mecánica / fontanería / ingeniería
- Generadores de respaldo: dedicados o compartidos, alarmas y acceso controlado
- Conexiones de CO2 y LN2: enviadas al laboratorio desde el «tanque» o cilindros conectados al mismo
- sistemas de vacío
- Calefacción, ventilación y aire adicionado (HVAC)
Los números y tipos de BSCs jugarán un papel importante en la construcción de un laboratorio de cultivo de tejidos y probablemente agregue mucho al costo de la construcción, los aires acondicionados deben ser dimensionados a favor del número y tipos de BSCs, así como cualquier otro equipo productor de calor, como incubadoras y congeladores.
El acondicionamiento eficiente y cómodo del aire en el laboratorio es uno de los problemas más desafiantes del diseño y funcionamiento del mismo, llega a ser muy incómodo trabajar en laboratorios donde el calor no es controlado debido a la instalación de un sistema HVAC que no es de suficiente capacidad para manejar el calor producido por los BSCs y las incubadoras.
El flujo de aire y su dirección (negativo, positivo o neutro) es una consideración clave al diseñar el laboratorio y es crítico para la operación segura del laboratorio de cultivo de células madre.
- Capacidad eléctrica y enrutamiento
Predecir con precisión el número de BSCs, congeladores y otros equipos importantes y determinar la cantidad de electricidad que extraen y el calor que producen es fundamental para calcular la capacidad eléctrica correcta para mantener un ambiente de trabajo seguro.
Los requisitos de potencia para todos los equipos, así como la ubicación de las tomas de corriente, los interruptores de luz, la determinación de las necesidades de energía de emergencia, la proximidad de los tomacorrientes a los grifos de agua y la coordinación de la colocación de las salidas con el diseñador de muebles modular es parte del diseño detallado.
Es necesario que haya circuitos dedicados suficientes para manejar todos los equipos actuales, así como una futura expansión, de igual modo, las incubadoras y congeladores deben estar en circuitos generadores de respaldo y sistemas de alarma.
- Acabados interiores
- Pisos de vinilo
- Techos no porosos
- Recubrimientos y pintura lavable e impermeable
- Cubiertas y muebles impermeables
En esta tercera parte, terminaremos de cubrir los pasos y elementos necesarios para crear un laboratorio de investigación de células madre, si no has visto las partes anteriores, te sugerimos hacerlo, de forma que seas capaz de consumir nuestro contenido en el orden apropiado y tengas un mejor conocimiento general de lo que implica esta iniciativa.
Continuemos con el resto de elementos requeridos…
Laboratorio de cuarentena
La introducción de nuevas líneas de células en el laboratorio es la principal fuente por la cual los cultivos llegan a contaminarse, por lo tanto, es importante que los sistemas de control estén en su lugar para minimizar este riesgo, el sistema de control de cuarentena puede ser un laboratorio separado, o también es una opción viable que las células sean puestas en cuarentena mediante el uso de un procedimiento operativo específico donde la línea entrante sea cultivada al final del día por un personal dedicado en una incubadora dedicada hasta que se demuestre que está libre de contaminantes.
Almacenamiento
La importación y almacenamiento adecuados de materiales y reactivos, incluidas las existencias de células, es clave para el éxito a largo plazo del laboratorio, al establecer un nuevo laboratorio, tenemos la oportunidad de establecer sistemas para registrar los suministros entrantes y documentar sus pruebas y uso.
Muchos de los reactivos utilizados en los laboratorios de investigación de células madre se derivan de fuentes animales, y por lo tanto están sujetos a variabilidad de lote a lote que probablemente requiera pruebas internas para determinar qué lote es el adecuado para aplicaciones específicas en el laboratorio.
Además, el seguimiento de los materiales respecto a sus fechas de vencimiento y mantener el laboratorio adecuadamente abastecido es una función crítica que se facilita a través del uso de bases de datos y sistemas de inventario con códigos de barras.
La banca y la recuperación de un gran número de viales pequeños de materiales congelados tales como existencias de células y reactivos llega a ser un desafío, y se facilita enormemente mediante el desarrollo de un sistema de rastreo eficiente y fácil de usar.
Control de calidad
El laboratorio debe estar diseñado, equipado, provisto de personal y operado de manera que permita la producción de resultados experimentales confiables y reproducibles, si bien el laboratorio de investigación debe operar con suficiente flexibilidad para permitir el descubrimiento, el establecimiento de procedimientos operativos estándar y un sistema de control de calidad pueden proporcionar el fundamento sobre el cual se realicen nuevos descubrimientos (ver Fig. 2).
- Técnicas fiables: Al establecer un laboratorio de investigación para células madre, la identificación de técnicas fiables para el cultivo y la caracterización de líneas celulares es una función crítica del administrador del laboratorio.
Identificar técnicas que estén bien establecidas y utilizar líneas celulares que estén bien caracterizadas son las claves para establecer una base sólida, las nuevas tecnologías y el rápido crecimiento reciente en el campo de las células madre requieren que el director del laboratorio se mantenga al día con la literatura, especialmente en torno a las tecnologías que permiten la reprogramación dirigida de células somáticas para generar células madre pluripotentes inducidas.
Hay una creciente creencia de que uno puede «simplemente» generar algunas líneas iPSC y que será todo lo que se requiere para establecer un laboratorio de investigación de células madre, lo cual está lejos de la verdad.
Alentamos fuertemente el aprendizaje práctico en un laboratorio establecido o centro de capacitación en el arte y la ciencia del cultivo de células madre embrionarias humanas antes de embarcarse en el establecimiento de un laboratorio hPSC.
Además, recomendamos encarecidamente el mantenimiento de una línea de hESC bien caracterizada en laboratorio como el «patrón oro» para todos los trabajos subsiguientes de PSC.
- Reactivos validados: Es fundamental que los reactivos utilizados para cultivar y caracterizar hPSCs sean validados y demostrado ser confiables, el ensayo de lotes de reactivos, especialmente productos derivados de animales, tales como suero bovino fetal (FBS) y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), es crítico para operaciones exitosas y eficientes en el laboratorio de investigación de células madre.
- PSC de calidad: Es fundamental que los PSC utilizados en el laboratorio sean de poblaciones bien caracterizadas y tengan las características morfológicas y genéticas de líneas de PSC de alta calidad, por ello, hacemos hincapié en el uso bien caracterizado de líneas hESC como el «patrón oro» en los laboratorios que establezcan cultivos iPSC.
Tener estas hPSC de buena calidad en el laboratorio nos permitirá la prueba de reactivos y técnicas como la verificación de las propiedades de iPSC.
Aprobaciones de Supervisión
Al establecer un nuevo laboratorio de investigación de células madre, obtener la aprobación apropiada para el cultivo de las mismas quizá sea un proceso largo y tedioso.
Variables como el país, estado, ciudad e institución juegan un papel en el tipo de aprobación requerida para iniciar el cultivo.
En la mayoría de los casos, las solicitudes tendrán que ser presentadas en las juntas de revisión y comités especializados, los acuerdos de transferencia de material tendrán que ser obtenidos y llevados a cabo, y el personal tendrá que ser entrenado antes de que el primer hPSC sea cultivado en el nuevo laboratorio.
Por esta razón, sugerimos que se inicie el proceso de aprobación antes o durante el proceso de diseño del mismo.
